St. Nikolai wurde zwischen 1390 und 1480 an Stelle eines 1332 erwähnten Vorgängerbaus errichtet. Sie ist die Pfarrkirche der zweiten Flensburger Marktsiedlung, die bei der Gründung des in der Nachbarschaft befindlichen Franziskanerklosters um 1232 wohl bereits bestand, aber um 1300 mit dem Südermarkt einen planmäßig angelegten Marktplatz erhielt.
Die dreischiffige und siebenjochige, ursprünglich turmlose Stufenhalle wurde in zwei Abschnitten ausgeführt, wirkt aber dennoch einheitlich. Der 1. Bauabschnitt von 1390 bis zur Mitte des 15. Jahrhunderts umfasste die vier schmalen Westjoche und den Südervorbau nach lübisch-mecklenburgischen Vorbildern. Die Südseite des Südervorbaus ist durch dreifarbigen Schichtenwechsel unter Verwendung von glasierten Ziegeln und Vierpassblendenfriese hervorgehoben.
Im Innenraum entsteht durch die schmalen Seitenschiffe und die starke Überhöhung des Mittelschiffs eine fast basilikale Wirkung. Die kräftigen Rundpfeiler sind eine Anregung durch den Bau der Hamburger Katharinenkirche.
Der 2. Bauabschnitt um 1460 bis 1480 ist wohl einem Baumeister zuzurechnen, der zum Kreis des Meisters von Randers (Jütland) gehörte.
Der Westturm entstand erst 1516-82. Allerdings wurde er bei einem Blitzschlag zerstört und 1877 wieder neu aufgebaut. Dieser zweite Turmbau diente als Vorbild für den nachfolgenden Turmneubau der Flensburger Marienkirche.
Die Kirchenausstattung stammt vor allem aus der Renaissance und dem Barock. Bedeutendstes Ausstattungsstück ist der Renaissance-Orgelprospekt. Er wurde von 1604 bis 1609 von Heinrich Ringering geschaffen. Das Orgelwerk baute der Kopenhagener Hoforgelbaumeister Nicolas Maaß. 1709/10 wurde das Orgelwerk von Arp Schnitger im barocken Geist erweitert.
